蛋白質(zhì)印跡的發(fā)明者是斯坦福大學(xué)George Stark。Neal Burnette于1981年所著的AnalyticalBiochemistry中被稱為Western Blot。最開始做印跡的是一個叫Southern的科學(xué)家，但印跡的對象是DNA鏈，他把這種技術(shù)稱為Southern blot，后來出現(xiàn)了兩個過程相似，但是對象不同的印跡方法，一個針對RNA，一個對蛋白質(zhì)，人們分別把這兩種技術(shù)的稱為Northern和Western，與這兩個技術(shù)的發(fā)明人沒有關(guān)系了。

一、蛋白質(zhì)的樣品制備：

由于這一步方法各異，具體步驟請參考試劑盒的說明書即可。蛋白質(zhì)的樣品制備是Western Blotting的第一步，樣品制備是關(guān)鍵步驟，要求盡可能的獲得所有蛋白質(zhì)，應(yīng)注意以下問題:

> 在合適的鹽濃度下，應(yīng)保持蛋白質(zhì)的最大溶解性和可重復(fù)性。

> 選擇合適的表面活性劑和還原劑，破壞所有非共價結(jié)合的蛋白質(zhì)復(fù)合物和共價鍵二硫鍵，使其形成一個各自多肽的溶液。盡量去除核酸，多糖，脂類等干擾分子。

> 防止蛋白質(zhì)在樣品處理過程中的人為的修飾，制備過程應(yīng)在低溫下進(jìn)行，以避免細(xì)胞破碎釋放出的各種酶類的修飾（加入合適的蛋白酶抑制劑）。

> 樣品建議分裝成合適的量（比如分裝出20ul檢測蛋白質(zhì)定量用），然后保存與-20°或-80℃中長期保存，但要注意不要反復(fù)凍融，因為會使蛋白的抗原特性發(fā)生改變。

> 若蛋白提取過程存在問題或蛋白發(fā)生降解則很難進(jìn)行好之后的實驗，也就很難做出好的結(jié)果了。除此之外 loading buffer的作用也不容忽視，切莫使用不新鮮的上樣緩沖液，同時在處理時也應(yīng)注意將樣品與loading buffer混合均勻。

二、蛋白質(zhì)定量

如果要定量的話，一般選擇BCA或者Bradford方法，BCA要求檢測波長為562nm，Bradford為595nm。具體方法見各試劑盒說明書。為避免假陽性結(jié)果，建議先把lysis buffer加入BCA工作液或考馬G250混合看是否產(chǎn)生顏色。測完蛋白含量后，計算含50~100ug蛋白的溶液體積即為上樣量（一般8cm寬的迷你膠每個泳道最大能承載的蛋白質(zhì)量為150ug，所以如果從組織提取蛋白的話上樣量不宜過大）。

網(wǎng)上有人喜歡等質(zhì)量上樣（即每個泳道的上樣體積不一但質(zhì)量一定），也有使用等體積上樣（即先把各個樣品稀釋到某一固定濃度，然后等體積等質(zhì)量上樣，計算上樣體積時需包含loading buffer的體積）。按分子克隆的說法，還是使用等體積上樣比較好。

上樣總體積一般不超過15ul，加樣孔的最大限度可加20ul樣品。上樣前要將樣品置于燒杯內(nèi)，將燒杯置于石棉網(wǎng)上用酒精燈加熱至沸騰，在沸水中煮3~5min使蛋白充分變性。也可以使用PCR儀95°加熱5min，效果佳，操作方便。之后樣品可以在4℃冰箱短時間保存，也可在-20°冰箱保存數(shù)月，但是反復(fù)凍融會使蛋白質(zhì)的抗原特性改變。

三、SDS－PAGE電泳

1. 清洗玻璃板：

蘸點(diǎn)洗潔精輕輕擦洗。兩面都擦洗過后用自來水沖，再用蒸餾水沖洗干凈后立在筐里晾干。若不繼續(xù)使用，需用無水乙醇擦拭后晾干再妥善收起來，玻璃板之間墊玻璃紙隔開。梳子應(yīng)用水洗干凈，臨用前用無水乙醇擦拭晾干。

2. 灌膠與上樣

① 玻璃板對齊后放入夾中卡緊。然后垂直卡在架子上準(zhǔn)備灌膠（操作前先往玻璃板間灌水，檢查是否漏）。

② 按配膠試劑盒說明書選擇合適的分離膠濃度配置，最后加入TEMED，之后搖勻即可灌膠。配制凝膠時要充分混勻，此外應(yīng)保證試劑的新鮮，特別是過硫酸銨。灌膠時掌握好速度，避免氣泡產(chǎn)生（注意濃度越小的膠含水越多，凝固后膠體積縮小越多）。然后膠上加一層水，液封后的膠凝的更快（灌膠時開始可快一些，膠面快到所需高度時要放慢速度。

操作時膠一定要沿玻璃板流下，這樣膠中才不會有氣泡。加水液封時要很慢，否則膠會被沖變形）。未聚合的丙烯酰胺具有神經(jīng)毒性，操作時應(yīng)該戴手套防護(hù)。梳子插入濃縮膠時，應(yīng)確保沒有氣泡。注意給積層膠留出足夠的空間（分子克隆推薦長度為插入的梳齒長再加1cm）。

③ 當(dāng)水和膠之間有一條折射線時，說明膠已凝了。再等幾分鐘覺得差不多的時候就可倒去膠上層水并用吸水紙將水吸干。聚合時間由AP以及TEMED決定，通常在30min左右，AP不新鮮會導(dǎo)致聚合變慢，氣溫較低時膠是會凝得慢一些，必要時可適當(dāng)增加AP以及TEMED的量，但通常不會超過1h，若超過1h甚至更長仍未聚合，應(yīng)檢查配制的操作有無錯誤。由于TEMED催化APS釋放相關(guān)化學(xué)基團(tuán)，再由APS釋放的基團(tuán)催化Acr/Bis聚合，所以如果APS不新鮮的話加再多的TEMED效果也不佳，這就是為什么推薦APS每周新鮮配置的原因。

④ 按說明書配積層膠，加入TEMED后立即搖勻即可灌膠。將剩余空間灌滿濃縮膠然后將梳子插入濃縮膠中。灌膠時也要使膠沿玻璃板流下以免膠中有氣泡產(chǎn)生。插梳子時要使梳子保持水平。由于膠凝固時體積會收縮減小，從而使加樣孔的上樣體積減小，所以在濃縮膠凝固前最好在兩邊補(bǔ)膠至剛剛冒頂。待到濃縮膠凝固后，兩手分別捏住梳子的兩邊豎直向上輕輕將其拔出。

⑤ 趁積層膠聚合的這段時間，取適當(dāng)體積樣本混合1X SDS loading buffer（最好事前分裝好，每次從冰箱里取一管即可），95~100°加熱5min，若有沉淀可用稍低溫度，比如45~55°加熱1h達(dá)到變性的目的。我一般習(xí)慣分裝20ul到PCR管里，先和loading buffer混合好，臨用前用PCR儀加熱95°C 5min，效果不錯。

⑥ 膠做好后連同玻璃板一起安裝到電泳槽上，加入電泳緩沖液后開始準(zhǔn)備上樣（我們使用的是大連競邁科技公司的MV-III型小型單垂直板電泳槽，電泳液至少要漫過內(nèi)測的小玻璃板，電泳槽下面不用倒太多電泳液）。加樣前可用5ml注射器或加樣器先沖洗一下加樣孔。用微量加樣器貼壁吸取樣品，將樣品吸出不要吸進(jìn)氣泡。將加樣器針頭插至加樣孔中緩慢加入樣品（加樣太快可使樣品沖出加樣孔，若有氣泡也可能使樣品溢出。

加入下一個樣品時，進(jìn)樣器需在外槽電泳緩沖液中洗滌3次，以免交叉污染。目前我們做的mini膠上有10個上樣孔，一般在第一個孔加入marker（我用的是Fermentas預(yù)染marker），其余9個孔加入樣品，也可在頭尾孔內(nèi)加入marker，中間8個孔加樣品。加樣前樣品應(yīng)先離心，尤其是長時間放置的樣品。在未加樣的孔中應(yīng)加入等量的樣品緩沖液。上樣時，小心不要使樣品溢出而污染相臨加樣孔。也可使用10ul的槍頭就行，比用微量加樣器快很多，用槍頭時注意不要插得太深，容易把玻璃板撐開，樣品就落到膠和玻璃板之間的空隙了。

3. 電泳

電泳槽內(nèi)加入電泳緩沖液沖洗清除黏附在凝膠底部的氣和未聚合的丙烯酰胺，網(wǎng)上有資料建議低電壓短時間的預(yù)電泳，清除凝膠內(nèi)的雜質(zhì)，疏通凝膠孔徑以保證電泳過程中電泳的暢通，但是在《分子克隆》上卻反對這種做法，理由是會破壞緩沖系統(tǒng)pH的不連續(xù)性。請各位按照實際經(jīng)驗來做即可。電泳時間和電壓說法各異。按照各實驗室的慣例或者電泳槽的使用說明來操作。電泳至溴酚蘭剛跑出即可終止電泳，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。為減少蛋白質(zhì)條帶的擴(kuò)散，上樣后應(yīng)盡快進(jìn)行電泳，電泳結(jié)束后也應(yīng)直接或者轉(zhuǎn)印